Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.

Experimento 4.

Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.

I. Objetivos:

1.                        Aplicar la técnica de precipitación salina selectiva para separar las diferentes fracciones de proteína presentes en una mezcla.

2.                        Determinar el porcentaje de composición de una mezcla de proteína mediante análisis colorimétrico.

II. Marco Teórico:

El suero es el líquido de color ámbar que se obtiene por centrifugación y o decantación de la sangre que se ha coagulado.  En el proceso de coagulación se separan todas las proteínas de la coagulación (fibrinógeno), conjuntamente con las células plasmáticas. 

La viscosidad del suero de debe en gran parte a la albúmina, que  constituye el 55% de las proteínas totales.  Junto con los electrolitos, la albúmina participa en la regulación del volumen sanguíneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda hacia los espacios intersticiales; también participa en el transporte de ácidos grasos.  Las globulinas comprenden el 38% de las proteínas plasmáticas y corresponden a los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que liberan las células plasmáticas.  La función anticuerpo representa un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y bacterianas de los animales y el hombre.  Tres fracciones de globulinas (alfa, beta y gamma) se pueden cuantificar y caracterizar por fraccionamiento con soluciones salinas.

III. Materiales y Reactivos.

      Reactivos: Suero sanguíneo, Cloruro de sodio 0.9 %, Reactivo de Biureth, Solución patrón de albúmina, Sulfato de sodio 15.75%, 19.9% y 27.2%, celite.

      Materiales: Tubo de ensayo, Gotero, Pipetas 2, 5 y 10 ml, Colorímetro, Espátula, Centrifugadora.

                  

           Gotero                                 Espatula                        Pipeta               Centrifuga

                    

        

IV. Procedimiento.

    Determinación de las Proteínas Totales

Tubo	Suero	Albúmina	NaCl 0.9 %	Biureth	Agitar	Reposar
A = muestra	0.1 mL	-	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.1 = Patrón	-	0.1 mL	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.2= blanco	-	-	2.0 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.

              

      Separación y Determinación de las fracciones de proteínas.

Tubo	Suero	Na2SO4	Celite	Agitar	Reposar
B	0.5 mL	10 mL  al 15.75 %	0.5 g	por inversión	1 hora
C	0.5 mL	10 mL  al 19.9  %	0.5 g	por inversión	1 hora
D	0.5 mL	10 mL al  28  %	0.5 g	por inversión	1 hora

      Centrifugue por 5 min. a 3000 r.p.m.

      Decante el sobrenadante y adicione en tubos de ensayo las siguientes cantidades:

Tubo	sobrenadante	Biureth	Agitar	Reposar
B.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
C.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
D.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.



Pruebas Cualitativas para aminoácidos y proteínas

Experimento 3.

Pruebas Cualitativas para aminoácidos y proteínas

I. Objetivos:

Al finalizar el experimento el estudiante podrá:

1.    Aplicar pruebas cualitativas generales y específicas que permitan reconocer grupos químicos de los aminoácidos y proteínas.

2.    Someter soluciones de proteínas a desnaturalización con agentes físicos y químicos.

II. Marco Teórico:

Reacción con la ninhidrina: Los grupos amino libres de los aminoácidos, de los péptidos y las proteínas reaccionan con la ninhidrina a un pH entre 4 y 8, para dar un compuesto de intenso color azul púrpura.

Reacciones para cisteína y cistina: Cuando los aa y las proteínas que contienen grupos tiólicos se calientan en medio

 Reacción xantoproteica: Los aa, que contienen un núcleo aromático forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado.   Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio alcalino.

Reacción del ácido glioxílico para triptófano: El grupo indólico del triptófano reacciona con ácido glioxílico en presencia de ácido sulfúrico concentrado dando un complejo de color púrpura. 

Prueba para Arginina: El aa. Arginina contiene un grupo guanidino en la cadena lateral, este grupo reacciona con el reactivo de Sakaguchi (a-naftol/agua de Bromo) en medio alcalino para dar un compuesto de color rojo.

Pruebas generales de las proteínas

1. Prueba de Biureth

2. Desnaturalización por calor y pH extremos

3. Precipitación con cationes y aniones pesados y sales concentradas

III. Materiales .

a). Tubos de ensayo, gradillas, goteros, baño maría.

 Reactivos

 Soluciones al 1% en HCL IM 

 glicina

 tirosina

 triptófano

 Cisteína

 cistina

 prolina

 hidroxiprolina

 arginina

 fenilalanina

 Soluciones al 1% de albúmina

 caseína y gelatina

 Reactivo de Beirut

 HNO3 conc.

 NaOH 1OM

 ác. Acético glacial

 acetato de plomo II al 2%

 ac. Pícrico saturado

 ác, tricloroacético al 5%

IV. Procedimiento.

a.    Reacción de la  ninhidrina:

Coloque 1 mL de la solución de aa. en un tubo de ensayo y ajuste el pH cerca de la neutralidad; agregue 5  gotas de la solución de ninhidrina y deje hervir por 2 minutos.  Un color azul-púrpura constituye una prueba positiva.  (En el caso de prolina e hidroxiprolina es amarillo).

                               

b.    Reacción xantoproteica:

Agregue volúmenes iguales de ácido nítrico concentrado a aproximadamente 0.5 mL de la solución de aa., deje enfriar y observe el cambio de color.  Agregue suficiente NaOH 10M para que la solución sea fuertemente alcalina.  El cambio de coloración, de amarillo a naranja brillante es indicativo de un resultado positivo.  Repita la prueba con una solución de fenol.  La fenilalanina debe dar una reacción negativa o débilmente positiva.

c.    Prueba del ácido glioxílico:

A 2 mL  de una solución de triptófano añada 2 mL de ácido acético glacial, luego deje caer lentamente 2 mL de ácido sulfúrico concentrado por las paredes del tubo, hasta que se formen dos capas.  Si se forma un anillo violeta en la interfase de los líquidos, la reacción se considera positiva.  Ensaye también con glicina y tirosina.

d.    Prueba de Ehrlich para triptófano:

Agregue 2 mL del reactivo Ehrlich a 0.5 mL de la muestra.  Anote los colores que se producen.  Ensaye con triptófano, glicina, hidroxiprolina y urea.

e.    Reacciones para cisteína y cistina:

Mezcle 1 mL de solución de cisteína con 5 mL de NaOH.  Añada luego unas gotas de solución de acetato de plomo II.  Note los cambios.  Caliente hasta ebullición.

Para la prueba de nitroprusiato, combine 0.5 mL de una solución fresca de nitroprusiato de sodio con 2 mL de la muestra y añada 0.5 mL de hidróxido de amonio.  Repita la prueba con cistina, después de mezclar volúmenes iguales de cistina y NaCN (venenoso, no pipetee y deje reposar la solución durante unos minutos.

f.     Reacción para la arginina:

Mezcle 1 mL de NaOH 10M con 3 mL de la solución de aa. (arginina, glicina), y agregue dos gotas de a-naftol.  Agite fuertemente y añada, con mucha precaución y en la cámara de gases, cuatro o cinco gotas de agua bromo.  Note el color formado.  Ensaye también con urea.

g.    Ensayo de Biureth para proteínas:

A 2mL de la solución de proteína, añada 3 mL del reactivo de Biureth, mezcle y caliente a 37 ºC  durante 10 minutos.  Deje enfriar y observe el color formado.  Ensaye con gelatina, caseína y albúmina.

h.    Desnaturalización por calor y pH extremos

En tres tubos de ensayo coloque 5 mL de la cada una de las proteínas y agregue 0.5 mL de HCI 1Mm 0.5 mL de NaOH 1M y 0.5 mL de agua.  Coloque los tubos en baño de agua hirviendo durante 10 minutos y enfríe s temperatura ambiente.  Ajuste los tubos ácidos y alcalinos hasta la neutralidad.  Comente sus observaciones.

A 2 mL de la solución de proteína, agregue lentamente por las paredes del tubo 2 mL de HNO3 conc. hasta que se formen dos capas, luego mezcle cuidadosamente los dos líquidos.  Anote sus observaciones.

i.      Precipitación con cationes de metales pesados

A 2 mL de la muestra de proteína agregue unas gotas de la solución salina de metal pesado (acetato de plomo y nitrato mercúrico).  Añada un exceso y anote sus observaciones. 

Nota: estas soluciones son tóxicas, no las descarte en las tinas de desagüe.

A 2mL de la solución de proteína añada unas gotas de reactivo acídico (ác. Tricloroacético, .ac. pícrico saturado).  Agregue NaOH diluido y observe el resultado a medida que sube el pH.