Experimento 10.

Determinación Del Perfil Lipidico.

I. Objetivos:

q  Interpretar los valores de lípidos séricos obtenidos en el laboratorio luego de un ayuno de 12 a 14 horas.

q  Interpretar correctamente los intervalos de los valores de los índices aterogénicos

q  Reconocer los factores de riesgo de la aterosclerosis

El perfil lipidito comprende en:

1- lípidos totales
2- triglicéridos
3- colesterol
4- fosfolipidos
5- electroforesis de proteínas.

DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS (TG)

                                                 lipoproteinlipasa

Triglicéridos   + agua                                               Glicerol + ácidos grasos

                                                    Glicerol quinasa

Glicerol  +   ATP                                                        Glicerol – 3P    +  ADP

                                       Glicerolfosfato oxidasa

Glicerol 3P   + O₂                                                       Dihidroxiacetona-P  + H₂O₂

                                                                    peroxidasa

H₂O₂    + 4-Aminofenazona  + p-clorofenol                   Quinona   +  agua

 

La cantidad de esta quinona formada es proporcional a la concentración de triglicéridos.

Procedimiento:

Preparar los siguientes tubos de ensayo:

                            

Tubo blanco	Tubo patrón	Tubo muestra
30 uL de agua destilada	30 uL del patrón de triglicéridos	30 uL de suero humano
3 mL de reactivo de color enzimático para TG	3 mL de reactivo de color enzimático para TG	3 mL de reactivo de color enzimático para TG

v  Homogenizar las muestras e incubar a 37°C durante 5 minutos. 

v  Leer la absorbancia de patrón y muestras a 500 nm.  El color permanece estable durante 30 minutos.

TRIGLICÉRIDOS (mg/dL):   absorbancia de la muestra / absorbancia del patrón                               (concentración del patrón)

Valores normales menores de 150 mg/dL

Valores sospechosos mayores de 150 mg/dL

Valores elevados mayores de 200 mg/Dl

DETERMINACIÓN DE COLESTEROL:

                                         Colesterol esterasa

Esteres de colesterol                                                    colesterol  +  ácidos grasos

                                         Colesterol oxidasa

Colesterol  +    O₂                                                          colest –4-en-3 ona  +  H₂O₂

                                                            Peroxidasa

H₂O₂   +  4 aminoantipirina  + Fenol                               quinoneimina  +  4 H₂O

 

 Procedimento:

Preparar los siguientes tubos de ensayo:

Tubo blanco	Tubo patrón	Tubo muestra
30 uL de agua destilada	30 uL del patrón de colesterol	30 uL de suero humano, plasma con heparina o EDTA
3 mL de reactivo para colesterol	3 mL de reactivo para colesterol	3 mL de reactivo para colesterol

v  Homogenizar las muestras e incubar por 10 minutos a 37°C,

v  Leer en el espectrofotómetro antes de 30 minutos a una longitud de onda de 500 nm.

Colesterol (mg/dL):   absorbancia de la muestra / absorbancia del patrón                               (concentración del patrón)

Valores normales menores de 200 mg/dL

Valores normales menores de 180 mg/dL para menores de 30 años.

DETRMINACION DE HDL – COLESTEROL

PROCEDIMIENTO:

v  Adicionar en un tubo de centrífuga 200 uL suero (plasma con EDTA) y 500 uL de reactivo precipitante, homogenizar la solución y centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos.

v  Separe el sobrenadante claro y emplearlo para la determinación de HDL – Colesterol.

Preparar los siguientes tubos de ensayo:

Tubo blanco	Tubo patrón	Tubo muestra
300 uL de agua destilada	300 uL del patrón de HDL – Colesterol	300 uL de sobrenadante
3 mL de reactivo para colesterol	3 mL de reactivo para colesterol	3 mL de reactivo para colesterol

v  Homogenizar e incubar durante 5 minutos a 37°C. 

v  Leer la absorbancia de la muestra frente al blanco a 500 nm.