Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.

Experimento 4.

Separación y cuantificación de fracciones proteínicas del suero.

I. Objetivos:

1.                        Aplicar la técnica de precipitación salina selectiva para separar las diferentes fracciones de proteína presentes en una mezcla.

2.                        Determinar el porcentaje de composición de una mezcla de proteína mediante análisis colorimétrico.

II. Marco Teórico:

El suero es el líquido de color ámbar que se obtiene por centrifugación y o decantación de la sangre que se ha coagulado.  En el proceso de coagulación se separan todas las proteínas de la coagulación (fibrinógeno), conjuntamente con las células plasmáticas. 

La viscosidad del suero de debe en gran parte a la albúmina, que  constituye el 55% de las proteínas totales.  Junto con los electrolitos, la albúmina participa en la regulación del volumen sanguíneo, al evitar que el agua que forma parte de la sangre difunda hacia los espacios intersticiales; también participa en el transporte de ácidos grasos.  Las globulinas comprenden el 38% de las proteínas plasmáticas y corresponden a los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que liberan las células plasmáticas.  La función anticuerpo representa un crucial mecanismo de defensa contra infecciones virales y bacterianas de los animales y el hombre.  Tres fracciones de globulinas (alfa, beta y gamma) se pueden cuantificar y caracterizar por fraccionamiento con soluciones salinas.

III. Materiales y Reactivos.

      Reactivos: Suero sanguíneo, Cloruro de sodio 0.9 %, Reactivo de Biureth, Solución patrón de albúmina, Sulfato de sodio 15.75%, 19.9% y 27.2%, celite.

      Materiales: Tubo de ensayo, Gotero, Pipetas 2, 5 y 10 ml, Colorímetro, Espátula, Centrifugadora.

                  

           Gotero                                 Espatula                        Pipeta               Centrifuga

                    

        

IV. Procedimiento.

    Determinación de las Proteínas Totales

Tubo	Suero	Albúmina	NaCl 0.9 %	Biureth	Agitar	Reposar
A = muestra	0.1 mL	-	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.1 = Patrón	-	0.1 mL	1.9 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
A.2= blanco	-	-	2.0 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.

              

      Separación y Determinación de las fracciones de proteínas.

Tubo	Suero	Na2SO4	Celite	Agitar	Reposar
B	0.5 mL	10 mL  al 15.75 %	0.5 g	por inversión	1 hora
C	0.5 mL	10 mL  al 19.9  %	0.5 g	por inversión	1 hora
D	0.5 mL	10 mL al  28  %	0.5 g	por inversión	1 hora

      Centrifugue por 5 min. a 3000 r.p.m.

      Decante el sobrenadante y adicione en tubos de ensayo las siguientes cantidades:

Tubo	sobrenadante	Biureth	Agitar	Reposar
B.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
C.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.
D.1	2 mL	8.0 mL	por inversión	10 min.

      Determine la lectura en el colorímetro a 540 nm.