actividad enzimatica de la ureasa

Experimento 6.

                         Actividad Enzimática de la Ureasa

I.         Objetivos:

Al finalizar el experimento el estudiante estará en capacidad de:

1.    Determinar la actividad enzimática de la Ureasa presente en la harina de soya.

2.    Calcular la Km. de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.

II. Marco Teórico:

Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones químicas que tienen lugar en los tejidos vivos, disminuyendo el nivel de la energía de activación, propia de las reacciones.  Se entiende por energía de activación al valor de la energía que es necesario aplicar (en forma de calor, electricidad o radiación) para que dos moléculas determinadas colisionen y se produzca una reacción química entre ellas.

Características de la acción enzimática:

1-    Especificidad de Sustrato: El sustrato es la molécula sobre la que la enzima ejerce su acción catalítica.

2-    Especificidad de acción: Cada reacción esta catalizada por una enzima específica

En el estudio de la actividad enzimática de la ureasa, se titula el amoníaco formado con ácido clorhídrico valorado y se reporta al actividad enzimática en  moles de producto formado por minuto.  Se verifican las siguientes reacciones.

                               Ureasa

 (NH2)2CO                                               2NH3      +      CO2

   Urea                                                 Amoniaco

NH3     +    H2O                                     NH4 OH

NH4OH  +  HCl                                        NH4Cl   +      H2O.                   

III. Materiales y Reactivos.

a). Urea 0.25 M, Amortiguador: KH2PO4, Ureasa, HCl 0.2 M, indicador rojo de fenol y  azul de timol. Cloruro de mercurio.

b). Tubos de ensayo, Pipetas, Vasos químicos, Gotero, Sistema de titulación

                       

sistema de titulacion          Vasos quimicos

 gotero                                       tubos de ensayo

 IV. Procedimiento.

      Prepare los siguientes tubos de ensayo:

Tubo	Urea 0.25 M (mL)	Amortiguador (mL)	Agua (mL)	HgCl	Reposar por 5 minutos Todos los tubos	Enzima	Reposar por      30  minutos A 30 0C.
1	0.5	4.5	7.0	-		3.0 mL
2	1.0	4.5	6.5	-		3.0 mL
3	2.0	4.5	5.5	-		3.0 mL
4	5.0	4.5	2.5	-		3.0 mL
5	7.5	4.5	-	-		3.0 mL
6	7.5	4.5	-	8 gotas		3.0 mL

      Después de los 30 min, adicionar del tubo 1 al tubo 5,  8 gotas de. HgCl2 Agitar

       

      PRECAUCION: El HgCl2  es toxico y por lo tanto lave muy bien sus manos al terminar el laboratorio.  No desechar las soluciones en las tinas.

      Arme el sistema de titulación

      Extraiga alícuotas de 5ml en Erlenmeyer de cada una de las muestras, y  adicione a cada muestra 2 gotas de rojo de fenol y 4 gotas de azul de timol

      Comience a titular las muestras, en el siguiente orden  muestra 6, 1,2,3,4 y 5. Hasta obtener una coloración violeta

El calculo de las mili moles de amoniaco por minuto (m mol de NH3 / min.) se obtiene de la siguiente manera:

Para:

Tubo 1 =Volumen promedio de  HCl   x   Molaridad de  HCl  = m mol de NH3 / min.

El cálculo de la concentración de sustrato se obtiene de la siguiente manera:

Tubo 1= (Volumen inicial de urea)  (concentración inicial de urea) = (Volumen final de urea) (concentración final  de urea).

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