Electroforesis de proteínas del suero humano en gel de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes

Experimento 5

Electroforesis de proteínas del suero humano
en gel de poliacrilamida bajo condiciones
desnaturalizantes

INTRODUCCIÓN

Electroforesis

Electroforesis es la migración de moléculas cargadas en solución como respuesta a la presencia de un campo eléctrico. La velocidad de migración depende principalmente de la fuerza del campo, de la carga, forma, masa y tamaño de la molécula, así como de la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el que las moléculas se estén moviendo. Como herramienta analítica, la electroforesis es rápida, sensible y simple. La electroforesis es ampliamente usada para estudiar propiedades de especies cargadas en solución, y como una técnica de separación.

Electroforesis de proteínas del suero humano

Las proteínas presentes en el suero humano pueden agruparse en 4 fracciones dependiendo de su mobilidad electroforética: Albúminas, alpha, beta y gamma globulinas. La mayoría de las alpha y beta globulinas son sintetizadas en el hígado, mientras que las gamma globulinas son producidas por linfocitos y células plasmáticas.

MATERIALES Y EQUIPOS

Cámara de electroforesis
Fuente de voltaje
Enfriador a 4°C


 
Solución stock monómero (Acrilamida 29,2%, bisacrilamida 0,8%)
Amortiguador Tris-HCl 1,5M pH 8,8
Amortiguador Tris-HCl 0,5M pH 6,8
Amortiguador Trisbase-glicina pH 8,3 (5X)
Solución stock SDS 10%
Persulfato de amonio al 10% (recién preparado)
TEMED




Amortiguador reductor para las muestras :  SDS                   2-mercaptoetanol
                                                    Glicerol               Azul de bromofenol
                                                    Amortiguador pH 6,8
Fijador A (Metanol 50%, ácido acético 5%)
Fijador B (Metanol 50%)
Sensibilizador (Tiosulfato de sodio 0,02%)
Marcador (Nitrato de plata 0,1%)
Revelador (Formaldehído 0,04%, carbonato de sodio 2%)
Enjuage (Acido acético 5%)
Agua desionizada
 
Procedimiento 

Proiedades

Preparación del gel

Precaución: La acrilamida es un potente neurotóxico de carácter acumulativo, sus soluciones no deben pipetearse con la boca!. Para preparar el gel de resolución mezcle 1,75ml de agua desionizada, 1,25 ml de amortiguador pH 8,8 , 2,0 ml de solución de monómero, 50 ml solución de SDS, degasifique al vacío por 15 minutos y agrege 50ml de solución de persulfato de amonio y 5 ml de TEMED. Vierta la solución resultante al portaplacas como se discute en ELECTROFORESIS VERTICAL, agregue cuidadosamente un poco de agua sobre la mezcla anterior para evitar deshidratación del gel y deje polimerizar por 40 minutos.  Retire el agua, y vierta en el portaplacas manteniendo el peine inclinado como se aconseja en ELECTROFORESIS VERTICAL el gel de apiñamiento preparado con 3,0ml de agua desionizada, 1,25ml de amortiguador pH 6,8 , 0,67ml de solución de monómero, 50 ml de solución de SDS, 50 ml de persulfato de amonio y 10 ml de TEMED. Deje polimerizar por 40 minutos.

Preparación de la muestra

La muestra de suero centrifugada y dializada (Opcional) se diluye hasta unas cuatro veces en el amortiguador reductor y se calienta a 95°C por 4 minutos.

Sembrado de la muestra y corrido de la electroforesis

Después de armada la celda se agrega el amortiguador de corrido (véase ELECTROFORESIS VERTICAL) y se siembran unos 4ml de muestra en cada reservorio, se tapa la celda y se hace el corrido a 200V por 42 minutos.

Revelado de la placa
La placa se coloca en los siguientes baños por el tiempo especificado:
- Fijador A, 20min
- Fijador B, 10min
- Agua, 10min
- Sensibilizador, 1min
- Agua, 1min (2 veces)
- Marcador, 20min, 4°C
- Agua, 1min (2 veces)
- Revelador. Se lleva a la intensidad deseada (Usar fondo blanco)
- Enjuage, 1min