Estudio de Inhibición de la Fenoloxidasa de la papa

Experimento 7.

Estudio de Inhibición de la Fenoloxidasa de la papa

I. Objetivos:

a.    Determinar la actividad enzimática de la fenoloxidasa presente  en extractos de papa.

b.    Calcular la Km de la enzima de los datos de actividad enzimática, frente a diferentes concentraciones de sustrato.

c.    Estudiar el tipo de inhibición que ejerce el ácido benzoico sobre la actividad de la fenoloxidasa de la papa.

II. Marco Teórico:

Las enzimas son catalizadores muy potentes y eficaces, químicamente son proteínas.  Como catalizadores, las enzimas actúan en pequeña cantidad y se recuperan indefinidamente.  No llevan a cabo reacciones que sean energéticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios químicos, sino que aceleran su consecución.

La característica más sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad.  Esta es doble y explica que no se formen subproductos: (1) Especificidad de sustrato.  El sustrato (S) es la molécula sobre la que el enzima ejerce su acción catalítica. (2) Especificidad de acción.  Cada reacción está catalizada por un enzima específico.

La acción enzimática se caracteriza por la formación de un complejo que representa el estado de transición.

      III. Materiales y Reactivos.

a).Baño termométrico, tubos de ensayo, gradilla, bureta de 50 mL, goteros, pipetas de 5 y 10 mL, erlenmeyers de 125 mL, gaza, embudo buchner, licuadora, espectrofotómetro visible.

b).Pirogalol (1,2,3 trihidroxibenceno) 1 % (solución madre), amortiguador, citrato 0.1 M de pH 6, NaF 1% -ac., Benzoico 0.02%, Sulfato de Amonio, solución saturada 60 – 70%.  El estudiante debe traer una papa congelada.

 espectrofotómetro

       tubos de ensayos

bureta                                           gotero 

IV.Procedimiento.

v  Es importante que antes de iniciar el procedimiento de extracción de la enzima, todos los materiales estén en frío, incluyendo el NaF, la licuadora y el sistema de filtración previamente lavado con agua fría.  También se recomienda tener los tubos de ensayo listos con las soluciones necesarias para medir la actividad.

v  Corte la papa congelada en trozos de 1 cm por lado.  Elimine la cáscara y coloque los trozos en 200 ml solución de NaF al 1%.  Licue a alta velocidad por dos minutos.

v  Filtre inmediatamente en buchner que tenga varias capas de gaza, aplicando succión.  Coloque en el baño con hielo inmediatamente.

v  Enumere seis tubos de ensayo y añada los volúmenes en ml de las soluciones correspondientes, como se detalla en el cuadro.

v  Realizar  lecturas de % transmitancia cada 30 s, o de acuerdo al tiempo que señale el profesor.

v  Dejar  de tomar lecturas cuando las mismas se repiten unas tres veces seguidas.

SOLUCIONES/TUBO	1	2	3	4	5	6
Estudio de la actividad enzimática sin inhibidor
mL Amortiguador pH 6	4	4	4	4	4	4
mL Agua destilada	9	7	5	3	1	11
mL de Pirogalol 1%	2	4	6	8	10	-
Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm.  Proceder con un tubo a la vez y añadir la enzima.
mL Enzima	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5		0.5
Estudio de inhibición con ác. Benzoico 0.02%
mL Amortiguador pH 6	4	4	4	4	4
mL Agua destilada	8	6	4	2	0
ml de DOPA 1%	2	4	6	8	10
ml de ác. Benzoico 0.02%	1	1	1	1	1
Ajustar el cronómetro y el espectrofotómetro a 475 nm. Proceder con un tubo a la vez y añadir 2ml de enzima